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化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究

更新时间:2017-03-29 点击数:866

研究技术指导原则

(第三稿)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二○○四年十月

 

 

目      录

一、概述.......................................................................................................... 1

二、总则.......................................................................................................... 1

(一)刺激性试验........................................................................................... 3

1、目的..................................................................................................... 3

2、刺激性试验设计中应考虑的问题.................................................. 3

3、皮肤刺激性试验................................................................................ 4

4、注射给药部位的刺激性试验........................................................... 4

5、眼刺激性试验.................................................................................... 5

6、其他途径给药部位刺激性试验....................................................... 5

(二)过敏性试验........................................................................................... 5

1、目的..................................................................................................... 5

2、过敏性试验设计中应考虑的问题.................................................. 6

3、经皮给药过敏性试验....................................................................... 7

4、注射给药过敏性试验....................................................................... 7

5、其他途径给药过敏性试验............................................................... 7

6、试验方法............................................................................................ 7

(三)溶血性试验........................................................................................... 8

1、目的..................................................................................................... 8

2、适用范围............................................................................................ 8

3、溶血性试验设计中应考虑的问题.................................................. 8

4、试验方法............................................................................................ 8

(四)试验报告................................................................................................ 9

(五)结果评价................................................................................................ 9

(六)关注的几个问题................................................................................... 9

三、参考文献................................................................................................ 10

四、附录........................................................................................................ 11

1、刺激性试验方法.............................................................................. 11

2、过敏性试验方法.............................................................................. 19

3、溶血性试验方法.............................................................................. 27

五、著者........................................................................................................ 29

化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则起草说明........ 30

 

 


化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术
指导原则

一、 概述

化学药物刺激性、过敏性和溶血性是指化学药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药,对用药局部产生的毒性(如刺激性和过敏性等)和/或对全身产生的毒性(如过敏性和溶血性等)。它是临床前安全性评价的组成部分。

药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质(如pH值、渗透压等)均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生,因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性,以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考,保障临床用药的安全、有效。

本指导原则适用于化学药物,主要内容包括化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究和评价的总体原则、一般原则和常用试验方法。

二、总则

根据《药品注册管理办法》(试行)的规定,化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》(GLP)。

试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。

化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究试验设计应结合毒性的发生机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法等来考虑。动物种属的选择应依据拟采用的试验模型和观察的指标。动物的性别、年龄和生理状态应符合拟采用试验动物模型的要求。受试物应与临床应用制剂一致。给药方案应根据所采用的试验模型和拟定的临床应用情况来决定。观察部位除给药部位外,同时应考虑周围组织或可能暴露于受试物的部位。

如果受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性,其他非临床安全性(如长期毒性)研究结果可充分反映受试物的刺激性、过敏性和溶血性中的某一毒性时,则可不单独进行相应的毒性研究。

化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究时应采用与临床应用制剂一致,符合临床用质量标准规定的受试物,并注明其名称、来源、批号、含量(或规格)、保存条件及配制方法等,其中辅料和杂质等的名称和量应尽可能明确,并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶剂等应标明批号、规格和生产厂家,并符合试验要求。

进行研究时应采用合理的方法和手段,以避免假阴性或假阳性试验结果的出现。

受试物的刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究提示有一定毒性时,应与上市的相同给药途径制剂进行比较研究,比较研究的样本例数的确定应遵循统计学的基本原理。

评价受试物的刺激性、过敏性和溶血性时,应结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合考虑,明确受试物是否能进行临床试验及临床应用时应关注的问题等。

(一)刺激性试验

1、目的

刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应,若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验是观察动物的血管、肌肉、皮肤、粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。

2、刺激性试验设计中应考虑的问题

2.1  实验动物的选择

依据拟采用的试验模型和观察指标选择试验动物,一般每个试验选择一种动物进行评价。

2.2  给药的频率与期限

给药频率和期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药的制剂,一般每天给药一次,给药期限最长不超过4周。单次给药的制剂可用单次给药的方法进行试验。

2.3  可逆性观察

为明确毒性反应的性质,建议进行停药后恢复期的观察。局部毒性反应的可逆性评价应包括局部及相关部位的反应。

2.4  受试物

受试物应与临床应用制剂一致。

2.5  对照组

以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照。必要时采用已上市制剂作对照。

2.6  剂量

剂量设计主要应该考虑受试物浓度和总剂量。一般采用与临床制剂相同浓度,设一个剂量组,可以通过改变给药频率进行剂量的调整,必要时应该进行不同浓度的刺激性试验。对于皮肤刺激性试验,在给药面积不变的情况下,不应通过增加厚度来满足增加给药量的目的。

2.7  给药方案

给药方案原则上应与临床用药方案一致,但设计给药容积、速率和频率时,应考虑所选用动物模型给药部位的解剖和生理特点。

2.8         统计处理

根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。

3、皮肤刺激性试验

3.1  经皮给药制剂及可能接触皮肤的非口服给药制剂应考虑进行皮肤刺激性试验。

3.2  在急性毒性试验、长期毒性试验或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性,其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性,可不必进行单独的皮肤刺激性试验。

3.3  试验方法

参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。

4、注射给药部位的刺激性试验

4.1  注射剂应考虑进行注射给药部位刺激性试验。

4.2  在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过注射给药部位刺激性,其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性,可不必进行单独的注射给药部位刺激性试验。

4.3  试验方法

参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。

5、眼刺激性试验

5.1  眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行眼刺激性试验。

5.2  在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过眼刺激性,其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性,可不必进行单独的眼刺激性试验。

5.3  试验方法

参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。

6、其他途径给药部位刺激性试验

可在总则和刺激性试验设计中应考虑的问题的指导下参考皮肤、注射给药部位和眼刺激性试验进行。

(二)过敏性试验

1、目的

过敏性又称超敏反应,指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应,是异常或病理性免疫反应。其分类采用目前普遍接受的分类法:Ⅰ型又称快发或速发过敏型,由IgE介导,主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等;Ⅱ型又称细胞毒型或溶细胞型,由IgG介导,主要表现为库姆斯试验阳性的溶血性贫血,粒细胞减少和血小板减少性紫癜;Ⅲ型又称免疫复合物型或血管炎型,由IgG、IgM介导,主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等;Ⅳ型又称迟发型或结核菌素型,由T淋巴细胞介导,主要表现为接触性皮炎。

光敏性包括光毒性(光刺激性)和光过敏性(光变态反应)两类,光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应,药物可通过直接作用或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应,系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应,为Ⅳ型过敏反应的特殊类型。过敏性试验是观察动物接触受试物后是否产生全身或局部过敏反应。

2、过敏性试验设计中应考虑的问题

2.1  进行何种过敏性研究应根据药物自身特点(如化学结构等)、其他药理毒理的实验结果,特别是长期毒性试验的结果、临床适应症及给药方式等确定。

2.2  具体试验方法的选择应根据给药途径,以及需考察的过敏性可能的发生机制确定,并应阐明合理性。如经皮给药需考虑做豚鼠最大化试验(Guinea-Pig Maximization Test, GPMT)、Buehler试验(BT);注射给药需考虑做全身主动过敏试验(ASA)和皮肤被动过敏试验(PCA);吸入给药需考虑做豚鼠吸入诱导和刺激试验。

2.3  剂量设计应合理,建议选择多个剂量以①进行剂量与过敏反应的量效关系研究,争取找出无过敏反应的剂量;②避免因剂量过低而导致假阴性结果的出现;③帮助判断阳性结果是否因强刺激反应引起。应设立阳性和阴性对照组。

2.4  由于实验动物模型的局限性,如目前仍无理想的Ⅱ和Ⅲ型过敏反应的动物模型;光过敏性动物模型的临床意义尚不明确等,因此一些药物的过敏性临床前评价可采取灵活的方式,但应有充分的理由,并应在医师使用手册和说明书中详细描述其可能的毒性,临床研究时进行相应的考察。

2.5  统计处理:根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。

3、经皮给药过敏性试验

应考察皮肤过敏性反应,通常采用BT或GPMT或其他合理的试验方法。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者,尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应(如全身过敏性反应等)。

4、注射给药过敏性试验

通常采用ASA和PCA或其他合理的方法考察全身过敏性反应,采用其他方法应阐明合理性。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏性反应的化合物相同或相似者,尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏性反应(如皮肤过敏性反应等)。

5、其他途径给药过敏性试验

吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药应结合受试物的自身特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应(如光过敏性反应等)。

6、试验方法

参见附录中过敏性试验常用方法和相关文献。

(三)溶血性试验

1、目的

溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血,为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应;非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血性试验是观察受试物是否能够引起溶血和红细胞凝聚等反应。

2、适用范围

凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。

3、溶血性试验设计中应考虑的问题

3.1  溶血反应发生机制复杂,目前尚无标准的临床前体内试验方法以全面评价药物制剂的溶血反应,因此推荐未有相同给药途径上市制剂在长期毒性研究中兼顾考察制剂的溶血性。试验时应注意观察溶血反应的有关指标及体征(如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白、肾炎和脾脏淤血等),如出现溶血时,应进行进一步研究。

3.2  对于已有相同给药途径上市注射剂常可采用常规体外试管法评价药物的溶血性,若体外试管法试验结果为阳性,建议与相同给药途径上市制剂进行比较性研究,必要时进行动物体内试验。

4、试验方法

参见附录中溶血性试验常用方法和相关文献。

(四)试验报告

试验报告应根据GLP的要求进行撰写。

(五)结果评价

说明方法、受试物和动物选用的合理性并分析其对实验结果的可能影响。

正确分析实验结果并理解实验结果的意义,判断毒性反应和毒性作用靶器官。

分析毒性试验的完整性,判断该毒性研究是否能较全面地反映药物给药后产生的毒性,并分析引起毒性作用的可能原因。

结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价,明确药物是否能进入临床试验及临床应用时应关注的问题等。

(六)关注的几个问题

对于化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究,有以下几个方面值得关注。

1、应体现整体性、综合性的原则

实际工作中应根据受试物自身特点,结合其药学、药理、毒理和临床研究工作进行刺激性、过敏性和溶血性研究和评价。

2、具体情况具体分析

目前已有试验方法仍存在一定的局限性,因此可采用本文推荐以外的其他方法以提供更有价值的试验结果,提高刺激性、过敏性和溶血性研究预测的灵敏性和准确性。但采用其他方法时应阐明其合理性并说明具体方法及操作流程。

三、参考文献

1、FDA Guidance for Industry Skin irritation and sensitization testing of generic transdermal drug products

2、FDA Guidance for Industry Photosafety testing

3、FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of investigation new drug

4、EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 Immunotoxicity

5、EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2500 Acute dermal irritation

6、EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2600 Skin sensitization

7、OECD  Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992)

8、EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2400 Acute eye irritation

9、EMEA Non-clinical local tolerance testing of medicinal products

10、ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices- Part 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity

11、日本厚生省  日本新药毒性试验指导原则 1989版

12、中华人民共和国卫生部药政局 新药(西药)临床及临床前研究指导原则汇编

13、徐叔云 卞如濂 陈修 药理实验方法学

14、陈奇 中药药理研究方法学

四、附录

本附录中收载的试验方法仅供参考,研究者应根据所研究药物的自身特点采用国内外公认的科学合理的试验方法,而并不仅限于附录中所收载的试验方法。

(一)刺激性试验方法

1、皮肤刺激性试验

1.1  实验动物

首选家兔,每组动物数4-8只,一般雌、雄各半,也可选用其他种属的动物(如小型猪等),选择家兔和小型猪以外的动物应阐明合理性。应设赋形剂对照,采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时对给药区(通常在背部)进行脱毛处理(可剪、剃或用适宜的脱毛剂)。去毛范围左、右各3 cm×3 cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤,有损伤的皮肤不宜进行试验。进行破损皮肤的刺激性研究时,在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。

1.2  给药方法

取受试物0.5 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上,然后用二层纱布(2.5 cm×2.5 cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖,再用无刺激性胶布和绷带加以固定;另一侧涂布赋形剂作对照。贴敷时间至少4小时。贴敷结束后,除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药,每次给药时间相同,贴敷期限一般不超过4周。

1.3         结果观察

在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。

单次给药皮肤刺激性试验,在去除药物后30-60分钟,24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤,有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。

多次给药皮肤刺激性试验,在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间,并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后,在去除药物后30-60分钟,24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤,有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。

1.4         结果评价

单次给药皮肤刺激性试验,计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值,按表2进行刺激强度评价。多次给药皮肤刺激性试验,首先计算每一观察时间点各组积分均值,然后计算观察期限内每天每只动物积分均值,按表2进行刺激强度评价。

表1.皮肤刺激反应评分标准


2、注射给药部位刺激性试验

2.1  实验动物

首选家兔,每组动物数不少于3只。应设生理盐水对照,可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径确定,可选用耳缘静脉,耳中心动脉(其它动物可选用前、后肢静脉及股动脉等),股和背部肌肉,侧胸壁皮下组织,静脉旁组织等。

2.2  给药方法

为最大可能地暴露毒性,应根据受试物的特点采用最可能暴露毒性的给药方法。一般而言按临床给药方案给予受试物,给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定,多次给药一般不超过7天。

2.3  结果观察

应根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药刺激性试验,在给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察;多次给药刺激性试验,每天给药前以及最后一次给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况,继续观察14-21天再进行组织病理学检查,以了解刺激性反应的可逆程度。

2.4  结果评价

根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。

3、眼刺激性试验

3.1  实验动物

首选家兔,每组动物数不少于3只。应设置生理盐水对照组,可采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时内对每只动物的双眼进行检查(包括使用荧光素钠检查)。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。

3.2  给药方法

每只眼睛滴入0.05-0.1ml或涂敷0.1g受试物,然后轻合眼睑约10秒。一般不需冲洗眼睛。给药期限应根据受试物拟用于临床的情况来决定,多次给药时每天给受试物的次数应与临床用药频率相同,连续给受试物2-4周,一般不超过4周。

3.3         结果观察

应根据受试物的特点和刺激性反应情况来选择适当的观察时间。通常单次给药眼刺激试验,在给药后1、2、4、24、48和72小时对眼部进行检查,也可根据受试物的特点适当调整观察时间;多次给药眼刺激试验,每天给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48和72小时对眼部进行检查,也可根据受试物的特点适当调整观察时间。如果在72小时未见任何刺激症状,试验则可结束。如存在持久性损伤,有必要延长观察期限,但一般不超过21天。

一般采用裂隙灯(或手持裂隙灯)进行眼刺激反应检查,也可根据刺激性反应情况采用其他的合适器械(如放大镜、生物显微镜等)。在整个观察过程中应进行荧光素染色检查。每次检查,都应记录眼部反应的分值(见表3)。除了观察所列出的结膜、角膜和虹膜损伤外,其他所观察到的损伤也应记录和报告。

3.4         结果评价

按表3的要求,将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分,将一组的积分总和除以动物数,即得最后分值。按表4判断其刺激程度。

表3 眼刺激反应分值标准




4、皮肤光毒性试验

光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用,即皮肤或全身接触或应用化学物质后,继而暴露于紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应。光毒性反应是光敏反应中最常见的一种反应。具有剂量依赖性,其临床表现与晒伤相似,表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着。严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。

4.1  实验动物

成年白色豚鼠,雌雄各半。

4.2  试验分组

应设阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予赋形剂或溶媒,阳性对照组给予8-甲氧基补骨脂素,受试物低剂量组给予临床用药浓度,高剂量组给予不引起皮肤刺激反应的浓度。正式试验的每组动物数至少6只。

4.3  UV光源

4.3.1  UV光源:波长为320-400nm的UVA,如含有UVB,其剂量不得超过0.1J/cm2。

4.3.2  强度的测定:用前需用辐射计量仪在实验动物背部照射区设6个点测定光强度(mw/cm2),以平均值计。

4.3.3  照射时间的计算:照射剂量为10J/cm2,按下式计算照射时间。

照射时间(秒)=照射剂量(10000mJ/cm2)/光强度(mJ/cm2·sec)

说明:1 mw/cm2=1 mJ/cm2·sec

4.4  试验步骤

4.4.1  进行正式光毒试验前18-24小时,将动物脊柱两侧皮肤去毛,试验部位皮肤需完好,无损伤及异常。备四块去毛区,每块去毛面积约为2cm×2cm。

4.4.2  将动物固定,按表5所示,在动物去毛区1和2涂敷0.2 ml(g)受试物或阳性对照药,3和4涂敷同体积(量)的赋形剂或溶媒。给药30分钟后,左侧用铝箔覆盖,胶带固定,右侧用UVA进行照射。

4.4.3  结束后分别于1、24、48和72h观察皮肤反应,根据表6判定每只动物皮肤反应评分。


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